Для приготовления ацидофилина используют закваску из одной культуры или комбинированную. Последняя состоит из равных количеств ацидофильной палочки молочнокислого стрептококка и дрожжей (ацидофильно-дрожжевое молоко)
Молоко пастеризуют при температуре не ниже 85°С, затем его охлаждают до 40 - 43°С в той же посуде, погружая ее в холодную воду.
С поверхности рабочей закваски, как обычно, снимают чистой ложкой слой в 2 - 3 см и остаток размешивают до сметанообразного состояния. Такую закваску добавляют в подготовленное молоко в количестве 5% и хорошо размешивают мутовкой. Молоко выдерживают до сквашивания. Первые 2 ч его перемешивают 2 - 3 раза.
Окончательное сквашивание наступает через 6 - 8 ч в зависимости от активности закваски.
Для готового ацидофилина характерны ровный и плотный сгусток, без резкого отделения сыворотки, консистенция после размешивания сметанообразная, несколько тягучая. Вкус приятный, кисломолочный. Кислотность в пределах от 80 до 130°Т. Ацидофилин хранят при температуре не выше 10°С. Можно изготовить сладкий ацидофилин, добавив перед сквашиванием сахарный сироп.